Expansão de linfócitos vírus-específicos para terapia celular em pacientes imunossuprimidos que foram submetidos ao transplante de medula óssea.
Hospital Israelita Albert Einstein

Expansão de linfócitos vírus-específicos para terapia celular em pacientes imunossuprimidos que foram submetidos ao transplante de medula óssea.
Expansão de Linfócitos
2018-2020

Expansão de linfócitos vírus-específicos para terapia celular em pacientes imunossuprimidos que foram submetidos ao transplante de medula óssea.
Resumo

Este projeto visa o desenvolvimento de pesquisa cientifica-tecnológica inovadora para assegurar o sucesso do pós-transplante de medula óssea. Ele representa uma nova modalidade terapêutica que, por meio do congelamento de células com resposta antiviral contra o citomegalovirus (CMV) presente em indivíduos saudáveis pode ser fonte de terapia para diferentes pacientes. Desta forma, contribuindo para a diminuição dos problemas relacionados ao pós-transplante e também para menor período de internação.

Esta pesquisa servirá como plataforma inicial de expansão de células vírus-específicas, para que futuramente essa terapia seja desenvolvida para outros tipos de vírus. A médio e longo prazo as terapias alternativas para o tratamento das reativações virais, no transplante de medula óssea, representarão um avanço para o Sistema Único de Saúde (SUS), comunidade científica e médica, beneficiando e, possivelmente, curando as reativações virais em pacientes com baixa imunidade no Brasil.

O projeto tem a missão de fortalecer e consolidar a Rede de Pesquisas em Terapia Celular do Departamento de Ciências e Tecnologia (DECIT) e da Secretaria das Ciências, Tecnologia e Insumos Estratégicos do Ministério da Saúde (SCTIE).
O objetivo geral deste projeto é amplificar a resposta imunológica antiviral existente em doadores saudáveis e desta forma desenvolver uma nova forma de terapia celular antiviral eficaz. Neste estudo também pretendemos validar e desenvolver a expansão das células antivirais em biorreator. Faz parte também desenvolver a criopreservação GMP (em sala limpa) das células vírus-específicas, criopreservar 30 células vírus específicas para CMV de diferentes HLAs, realizar seus controles de qualidade e utilizar as células geradas e validadas em sistema GMP em um Ensaio clinico de Fase I para 10 pacientes com reativação viral no contexto do pós-transplante de medula óssea.

Serão selecionados cerca de 30 doadores de plaquetas por aférese, após assinatura do consentimento informado. Será utilizado de sangue periférico ou como opção células que ficam presas no kit de coleta de plaqueta descartável, as quais comprovadamente possui grande quantidade de linfócitos.

Entre os envolvidos no projeto estão a SCTIE-MS, Comunidade Científica, instituições da rede SUS e Hospital Israelita Albert Einstein.



Introdução

Infecções e reativação de infecções por citomegalovírus humano (HCMV) é causa frequente de graves complicações em pacientes transplantdos de medula óssea. O HCMV é um herpes vírus e normalmente a infecção por este virus não apresenta nenhum sintoma em indivíduos saudáveis. Entretanto, em pacientes imunossuprimidos, as infecção viral pode comprometer vários órgãos causando muitos danos aos pacientes. Considerações específicas devem ser dadas a pacientes infectados por HCMV no pós-transplante alogênico de medula óssea.  O HCMV é um vírus presente na maioria da população, sendo presente em quase de 100% nas populações africana e asiática  e em cerca de 40-70% da população nos continentes americano e europeu. Então a presença deste virus após transplante requer atenção, devido sua alta prevalência na população. Pneumonia, úlceras em trato gastrointestinal e retinite são as principais manifestações nestes pacientes. Múltiplos fatores envolvem a reativação do HCMV no cenário pós-transplante, além do próprio tratamento utilizado no transplante. Devido a gravidade da infecção clínica, a falta de estratégias  que reduzam o risco de infecção e os efeitos colaterais dos antivirais levaram, a partir da década de 90, ao desenvolvimento de terapias alternativas de tratamento viral, principalmente do HCMV, baseando-se no fato de que a imunidade celular é um fator essencial no controle da infecção e da reativação do vírus. A terapia adotiva de transferência de imunidade de uma pessoa saudável para um paciente é uma destas estratégias e alvo de desenvolvimento neste estudo.



Métodos
Os métodos que estamos utilizando para desenvolver esta terapia antiviral se baseiam na obtenção apenas das células (linfócitos) capazes em reconhecer uma proteína presente na parte externa do virus HCMV (capsideo). Então as células são cultivadas com pequenos pedaços da proteina (peptídeos) do capsídeo viral, especificamente a proteina pp65, as células que produzem resposta a este estímulo, ou seja reconhecem a proteina viral, são selecionadas.
Então as células selecionadas e específicas são cultivadas com citocinas, que são proteínas capazes de estimular a proliferação de linfocitos, para que se tenha um número adequado de células. No final as células selecionadas e expandidas serão congeladas e então poderão após toda a fase de desenvolvimento de protocolo e os devidos controles de qualidade ser fornecidas para este tipo de terapia.

Resultados
Validação do material de partida - Células linfomononucleares provenientes do buffy-coat gerado na doação de plaquetas por doadores de sangue. Durante a doação de plaqueta por aférese existe acúmulo de células linfomononucleares na região central do kit de coleta, a qual nós denominamos de pião.  Neste compartimento “pião” o volume de sangue acumulado varia ente 8 e 10mL.
Uma vez que necessitamos de células mononucleares para a realização do estudo, realizamos a separação das mesmas utilizando Ficoll-PaqueTM Premium. Células mononucleares do sangue periférico (PBMCs) podem ser separadas dos outros componenetes do sangue, tais como eritrócitos e granulócitos, via centrifugação por diferença de gradiente de densidade. O Ficoll-PaqueTM possui densidade de 1.077 g/mL. Devido à sua alta densidade, eritrócitos, granulócitos e células mortas passam através da camada de Ficoll, enquando linfócitos e monócitos, devido às suas baixas densidades, acumulam-se na interface entre o plasma e o Ficoll-PaqueTM. Após separação de PBMCs por gradiente de densidade utilizando a solução Ficoll-PaqueTM, conseguimos obter isolado do pião em média 6,96x107células/mL (+1,6x107), sendo que o total de leucócitos varia entre 1,00x109 e 3,50x109 (n=5), números adequados para o início dos experimentos para expansão de linfócitos específicos para CMV. Ao realizarmos contagens automáticas em leitor de hemograma, verificamos que as PBMCs isoladas apresentam alta concentração de linfócitos (80% +10%) e monócitos (10% +4,8%) e baixo número de granulócitos (9% +5%) quando comparado ao sangue periférico (n=5). Adicionalmente, realizamos a imunofenotipagem por citometria de fluxo das populações de  leucócitos (CD45+), linfócitos T (CD3+), linfócitos T auxiliadores (CD3+CD4+), citotóxicos (CD3+CD8+), B (CD3-CD19+), células NK (CD3- CD16+CD56+) presentes na amostra .


Liderança
Nelson Hamerschlak - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes 
Luciana Cavalheiro Marti - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes


Equipe
Fernanda Agostini Rocha - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes
Caio Raony Farina Silveira - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes
Jose Mauro Kutner - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes
Andrea Tiemi Kondo - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP -  Lattes
Mariana Nassif Kerbauy - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP -  Lattes
Lucila Nassif Kerbauy - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes

Colaboração
Fernanda Pahim Santos - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Flavia Pereira de Carvalho - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Luana Vanessa Lopes Francisco - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Renato Tanjoni - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Silvia Lefone Milan - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Kauê Kamia de Menezes - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin


Área Técnica
Agência Nacional de Saúde Suplementar (ANS)
Secretaria de Atenção à Saúde (SAS)
Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos (SCTIE)
Rede de Pesquisas em Terapia Celular do Departamento de Ciências e Tecnologia (DECIT)

INDICADORES

CONHEÇA OUTROS PROJETOS
Processando