Tratamento inovador para Anemia Falciforme - uma doença negligenciada de alta relevância social.
Hospital Israelita Albert Einstein

Tratamento inovador para Anemia Falciforme - uma doença negligenciada de alta relevância social.
Anemia Falciforme
2018-2020

Tratamento inovador para Anemia Falciforme - uma doença negligenciada de alta relevância social.
Resumo

A anemia falciforme é uma doença genética, causada por uma mutação em um dos genes da hemoglobina, que afeta milhões de pessoas no mundo. Nessa doença, há a formação de uma hemoglobina anormal (hemoglobina S), que causa alteração do formato dos glóbulos vermelhos do sangue, resultando em destruição dos glóbulos vermelhos, anemia e obstrução de vasos sanguíneos. Os pacientes apresentam complicações como dores ósseas frequentes, infecções, acidente vascular cerebral e vivem menos que a população geral. Além disso, são frequentemente hospitalizados e recebem muitas transfusões de sangue, o que acarreta altos custos ao sistema de saúde.

O único tratamento curativo atualmente disponível é o transplante alogênico de células-tronco hematopoiéticas (que fabricam as células do sangue), ou seja, o transplante realizado com células de um doador saudável. Contudo, a falta de doadores compatíveis e os riscos associados ao transplante alogênico limitam seu uso. Por isso, são necessárias novas alternativas para a cura de pacientes com anemia falciforme.

Este projeto propõe desenvolver um novo tratamento curativo para a anemia falciforme, a terapia gênica, para corrigir a mutação causadora da doença. A correção é realizada diretamente no DNA de células-tronco da medula óssea do paciente, pois essas são as células responsáveis pela fabricação do sangue. As células-tronco serão coletadas do paciente, submetidas à edição gênica e reinfundidas no paciente. A vantagem de tal procedimento é utilizar as células do próprio paciente (autólogas), eliminando problemas relacionados ao transplante alogênico.

Para a edição gênica, utilizaremos a tecnologia/ferramenta CRISPR-CAS9. Nessa técnica, uma proteína guiada por um RNA específico corta a fita de DNA no local da mutação; a correção da mutação utiliza um molde de DNA contendo a sequência normal do gene. Nossos próximos objetivos são adquirir, dominar e aperfeiçoar essa técnica, bem como viabilizar sua migração para ambientes de boas práticas de manufatura, o que permitirá seu uso em pacientes.

Este projeto busca colaborar com as políticas do Sistema Único de Saúde (SUS), ampliando o leque de terapias curativas para os pacientes com anemia falciforme, visto que tal doença afeta populações mais vulneráveis economicamente e que dependem do SUS. Adquirir e aprimorar a técnica de terapia gênica permitirá seu implemento eficiente no país a custos mais baixos. Ao disponibilizar a terapia gênica, garantiremos o acesso à cura aos pacientes que não possuem doador de células tronco para o transplante alogênico, que são a maioria dos pacientes acometidos pela doença.

O público-alvo desse projeto são os portadores de anemia falciforme, que terão acesso a um tratamento menos complexo e mais acessível do que o transplante alogênico, capaz de ampliar o acesso à cura, interromper a progressão da doença, aumentar a expectativa de vida e potencialmente diminuir custos à saúde relacionados às complicações clínicas da anemia falciforme.



Introdução

A anemia falciforme (AF) é uma anemia de origem genética com alta prevalência na população brasileira, causada por uma mutação no gene da betaglobina (HBB), levando à formação de uma hemoglobina anormal (HbS), que se polimeriza quando desoxigenada e determina alterações na forma da hemácia. Como consequência, há hemólise, anemia e vasoclusão, levando a diversas complicações clínicas que resultam em menor expectativa de vida, alta morbidade e mortalidade. Terapias curativas para AF, além de aumentar a sobrevida e qualidade de vida dos pacientes, resultam em menor custo ao sistema de saúde em longo prazo. O transplante de células tronco hematopoiéticas (TCTH) alogênico é a única terapia curativa amplamente disponível. Contudo, embora demonstre bons resultados, é inacessível à maior parte dos pacientes devido à falta de doador compatível, e pode expô-los a complicações graves, como doença do enxerto contra o hospedeiro. A terapia gênica é potencialmente curativa para AF e não possui as complicações do TCTH alogênico, o que justifica o seu desenvolvimento. Neste contexto, a tecnologia de edição gênica CRISPR/Cas9 destaca-se como uma alternativa. CRISPR/Cas9 é um sistema que foi identificado em células de procariotos, e consiste em uma nuclease (Cas9) que cliva sítios específicos no DNA-alvo guiada por um pequeno RNA a ela associado, tornando esta ferramenta extremamente flexível para escolha do alvo de edição. Apesar de mais eficiente do que métodos anteriores de edição gênica, esta tecnologia ainda necessita de aprimoramento para que a edição gênica se torne uma opção real para a terapia gênica em AF. Sendo assim, o objetivo principal deste projeto é desenvolver as ferramentas e expertises em CRISPR/Cas9 para correção do defeito genético causador da anemia falciforme. Serão utilizados modelos in vitro e in vivo para análise da eficiência da correção do alelo mutado e da consequente geração de células-tronco capazes de gerar eritrócitos saudáveis.



Métodos

Edição gênica com CRISPR/Cas9: utilizaremos um single guide RNA sintético que tem como alvo a região da mutação pontual no éxon 1 do gene HBB em complexo com uma ribonucleoproteína (RNP) Cas9 de alta fidelidade. O complexo RNP Cas9-sgRNA será nucleoporado em células tronco hematopoiéticas (CTPH), e a sequência contendo a região de homologia para reparo será inserida via transdução de um vírus adeno-associado (rAAV6).

Validação da correção e funcionalidade celular: a eficiência da edição e a integridade funcional das células editadas serão investigadas por: (i) frequência de inserções ou deleções (indels) no locus HBB; (ii) identificação de erros (off-targets) na edição genômica do gene HBB; (iii) avaliação do potencial de diferenciação nas diferentes linhagens hematopoiéticas por meio de ensaio de formação de colônias (CFU) em metilcelulose ou em co-cultivo com células estromais; (iv) análise da frequência de correção da mutação p.E6V por PCR digital; (v) análise do potencial de diferenciação das CTPH in vitro; (vi) Análise da expressão de globinas (genes/proteínas) em eritrócitos diferenciados de pacientes com anemia falciforme.

Avaliação do potencial de reconstituição da medula óssea: CTPH CD34+ editadas serão transplantadas em modelos in vivo para validação de seu potencial de reconstituir a medula óssea e de produzir células sanguíneas diferenciadas em pelo menos duas linhagens hematopoiéticas in vivo. Para isso, amostras serão obtidas dos modelos e analisadas por citometria de fluxo para detecção de marcadores de linhagens hematopoiéticas humanas. Além disso, será analisado o estado do tetrâmero de hemoglobina no modelo in vivo através de cromatografia líquida de alta performance.



Resultados

Na primeira fase do projeto, foram feitas as contratações da equipe técnica responsável pelos experimentos, e os profissionais contratados passam por capacitações específicas para o desenvolvimento do projeto. Além disso, realizou-se a compra de materiais e equipamentos, bem como definiu-se o design experimental detalhado e cronograma dos experimentos.



Liderança

Luiz Vicente Rizzo - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes



Equipe
Ricardo Weinlich - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes
Karina Tozatto Maio - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes
Karina Griesi Oliveira - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP -Lattes 
Mariana Tereza de Lira Benício - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes 
Priscila Keiko Matsumoto Martin - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes 
Davi Coe Torres - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes
Camila Fernanda Hernandes - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP 
Andréa Sertié - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes
Aline Pacífico Rodrigues - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP 
Soely Moura Silva - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP 
Natalia Torres - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Lattes

Colaboração
Fernanda Pahim Santos - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Flavia Pereira de Carvalho - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Luana Vanessa Lopes Francisco - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Renato Tanjoni - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Silvia Lefone Milan - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin
Kauê Kamia de Menezes - Hospital Israelita Albert Einstein, São Paulo, SP - Linkedin


Área Técnica
Secretaria de Ciência, Tecnologia e Insumos Estratégicos (SCTIE)

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